相差顯微鏡介紹

相差顯微鏡介紹


    在顯微鏡下鏡檢時,視場中的樣品只有在反射光的波長(顏色)和振幅(亮度)與周圍介質有變化時,方能窺見被檢樣品?;畹臉悠范酁闊o色透明,照明光線通過這種物體時,透過或反射光的波長和振幅都不發生改變,所以用普通光學顯微鏡難以辨清活體的結構。必須借助于固定和染色等理化方法,使樣品和背景的反射或透射光在波長和振幅上發生變化,即在顏色和亮度上有所差異,以供識別。

    相差方法應用于生物學上的主要價值,在于它能對透明的活體進行直接觀察,無需采用使細胞致死的固定和染色的方法。染色合活體以有害的影響,甚至失真。由此才使相差法顯得異常重要。

1.相差

    相差是指同一光線經過折身率不同的介質其相位發生變化產生的差異。相位是指在某一時間上,光的波動所達到的位置。

    一般由于被檢物體(如不染色的細胞)所能產生的相差的差別太小,我們的眼睛是很難分辨出這種差別的。只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后,才能被分辨。

當光波通過兩種折射率不同的物質時,如空氣→水,或由空氣→玻璃,其波長、振幅和相位皆有不同的變化。例如:光波分別通過1cm厚的水和1cm厚的玻璃時,由于兩者折射率不同,通過它們的光波在相位上產生一定的差異。通過玻璃的光波相位落后,因為玻璃的密度和折射率比水大。所以,光波的波長和頻率都小于水。

    相差決定于光波所通過介質的折射率之差及其厚度,等于折射率與厚度的乘積之差(即光程之差),介質越厚或折射率越大,光波減速也越大。

    相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進行鏡檢的。

2.衍射與干涉

    用肉眼看不到的相差,只要利用衍射和干涉現象,把相差變為明暗的振幅差,就可能看到。

(1)衍射

    波在同一均勻媒質里傳播是沿直線方向進行的,如果在它傳播的方向上,遇到迎面擋住的孔或障礙物不比它的波長大得多,這時波就會明顯的繞到障礙物后面或孔的外面去(傳播路線發生了彎曲),這種現象叫波的衍射。

光也有衍射。光通過大小同光的波長的相差不大的細小物體時,也要發生衍射。

(2)干涉

    在同一種媒質里傳播的兩列波,如果它們的頻率和波長相同,在兩列波相交的區域里,由于疊加的結果,每一點的合振幅都是一定的,并且出現振動加強和振動減弱,這就是波的干涉。

光也發生干涉。光波通過小顆粒的物體后產生直射光(S)和衍射光(D),衍射光的光波振幅小,相位滯后。在光學系統中,這種直射光和衍射光相遇或光的疊加,振幅發生變化,光線或明或暗,就是光的干涉現象。

    如果物體粒子是折射率稍大于周圍媒質的極小的透明體時,由于光程(折射率和厚度的乘積)比較大,所以通過粒子的光比周圍的光在相位上有所推遲。這是因為被檢粒子的衍射光相位比直射光相位大約遲1/4波長的緣故。若是在直射光的通過點和大部分的衍射光的通過面放置吸收光的物質或推遲相位的物質時,就能分別改變直射光和衍射光的相位和振幅。

如果把直射光相位推遲1/4波長,使之與衍射光保持同一相位,合成波(P)等于直射光與衍射光振幅之和,即P=S+D,振幅加大,亮度提高。相反地,把衍射光相位推遲1/4波長,兩者的相差變成1/2波長,合成波的振幅等于兩波的振幅差,即P=S-D,這時亮度要減弱、變暗。光線的相位肉眼是看不到的,但是利用衍射和干涉的現象把相位差變成振幅差(明暗反差)就能用肉眼識別。圖1-2表示直射光(S細線)和衍射光(D虛線)干涉的現象。D的相位比S被推遲1/4波長。合成波(P粗線)由S與D兩者干涉而生成,形成被檢物體的像,振幅與S相同,相位稍推遲。


圖1-2  直射光和衍射光的干涉

S:細線,直射光; D:虛線,衍射光;P:粗線,合成波。 

3.相板的作用

    為了達到相差效應,在相差顯微鏡的物鏡中,裝有由光學玻璃制成的相板(phase plate)。在圓形相的平面上,有一圈與周圍(里外)相板厚度不同的或凸凹的圓環。其結構如圖1-3。相板分兩部分:

(1)共軛面(conjugate area):通常為環狀,是通過直射光的部分。其環是凸起的,也可能是凹陷的。

(2)補償面(complemetary area):共軛面內外兩側部分,是通過衍射光的部分。

在相板的共軛面或補償面上,涂有改變光波相位或吸收光線的物質。當光線通過時,使光波的相位或振幅改變,從而達到不同的目的與觀察效果。利用相板把光波相位推遲,振幅改變。相板的作用,除推遲直射光和衍射光的相位之外,還有吸收光,從而使亮度改變的作用。物鏡的后焦點位于透鏡中間而相板位于物鏡的后焦面上,所以,相板也安裝在透鏡中間。



圖1-3  相板的種類及構造


左上:吸收直射光的明反差相板平面和剖面圖; 左下:吸收直射光的喑反差相板剖面圖; 右上:吸收衍射光的明反差相板平面和剖面圖; 右下:吸收衍射光的暗反差相板剖面圖; 黑色:吸收光線層; 淺色:推遲相位層; 白色:玻璃。 

    相板的種類比較多,對光的吸收率高低不同,所以產生不同的反差效果,從反差上大致可分下列兩類(圖1-4):



圖1-4  明反差與暗反差

左:明反差,直射光(S)與衍射光(D)相位相同,兩波干涉結果合成波P=S+D,振幅加大; 右:暗反差,直射光與衍射光相位相差1/2波長,兩波干涉結果合成波P=S-D,振幅變小。 

(1)明反差(bright contrast)或負反差(negative contrast):是指在相差顯微鏡的視場中,物像亮度大于背景亮度的現象。在被檢物體的折射率大于媒質時,射光被相板的共軛面(因為在共軛面上涂有改變相位和吸收光線的物質)推遲1/4波長,同時吸收80%~90%,振幅變小,致使僅由直射光照射的背景變暗。通過補償面的衍射沒有變化,由于直射光推遲1/4波長,兩者(直射光與衍射光)有完全相同的相位,合成波P等于直射光S與衍射光D之合,即P=S+D,故振幅加大。物像是這兩種波的合成波造成,即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。

(2)暗反差(dark contrast)或正反差(positive contrast):是指在相差顯微鏡的視場中,背景亮度大于物像亮度的現象。與明反差相反,把通過補償面(因為在相板的補償面上涂有改變光波相位的物質)的衍射光推遲1/4波長,使衍射光與直射光的相位相差1/2波長,同時,直射光在共軛面(上涂吸光物質)被部分吸收。由于兩者在像點相互干涉的結果,使合成波(P=S-D)振幅變小,被檢物像的影像比背景顯著變暗。

根據上述原理所制成的顯微鏡便是相差顯微鏡,聚光鏡下面裝有環狀光闌,物鏡后焦面裝有相板。

4.相差顯微鏡的光路與成像

    相并顯微鏡的照明光束,由轉盤聚集器環狀光闌的環狀孔射入聚光鏡,透射載物臺上的被檢樣品,經樣品后,入射光除透射的直線光外,同時產生衍射光。衍射光的振幅較小,相位滯后。直射光和衍射光進入物鏡,前者由環狀的共軛面、后者由較大的補償面透過相板,前相互干涉造像。樣品的影像由直射光(S)和衍射光(D)經干涉后的合成波(P)造成,即P=S±D;背景僅由直射光形成。由于直射光和衍射光兩種光波的相位差異不同造成不同的反差效果,或明反差或暗反差不等視所用物鏡的相板類別而定。成像光束由物鏡射入目鏡,在目鏡的視場光闌處再次放大,并由出射光瞳射出目鏡。

5、裝置

    相差顯微鏡不同于普通光學顯微鏡,在裝置上有四種必不可缺的部件:相差物鏡、具有環狀光闌的轉盤聚光器、合軸調中望遠鏡和綠色的濾色鏡。

(1)相差物鏡(phase contrast objective)

    相差物鏡是顯微鏡特有的重要裝置。在相差特鏡內的后焦面上裝有種類不同的相板。相板由于前述的作用,造成視場中被檢樣品影像與背景不同的明暗反差,各具不同的效果。因物鏡內相板種類或構成的不同,物鏡在明暗反差上可區分為兩大類,即明反差(B)或負反差(N)物鏡和暗反差(D)或正反差(P)物鏡。物鏡的反差類別,用英文字母B或N或D或P標志在物鏡外殼上,并兼有高H(High)、中M(Medium)和低L(Low)等三種不同的反差。有的相差物鏡用ph字樣的標示。

    同一反差類別的物鏡,依放大率的不同,又可分為10×、20×、×40、和100×數種,因此,相關物鏡種類頗多,一套可多達20余種。

    相差物鏡多為消色差物鏡或平場消色差物鏡(PL)。

(2)轉盤聚光器(turret condenser)

    位于鏡臺之下,普通聚光器的所在位置上,由聚光鏡和環狀光闌(annular diapheragm)構成。環狀光闌位于聚光鏡之下,是一種特殊的光闌裝置,由大小不同的環狀通光孔構成,不同規格的通光孔——環狀光闌裝配在一個可旋轉的轉盤上,按需要調轉使用(圖1-5)。環狀光闌的環寬與直徑各不相同,與不同放大率的相差物鏡內的相板相匹配,不可濫用。轉盤前端朝向使用者一面有標示窗(孔),轉盤上的不同部位標有0、1、2、3和4或0、10、20、40和100字樣,通過標示窗顯現?!?”表示非相差的明視場的普通光闌。1或10、2


圖1-5  轉盤聚光器的構造

或20、3或40和4或100,表示與相應放大率的相差物鏡相匹配的不同規格的環狀光闌的標志。通過手動轉入的標示窗內之數字,表示該數字所代表的環狀光闌已進入光路。

(3)合軸調中望遠鏡(centering telescope)

    合軸調中望遠鏡簡稱CT,又名合軸調中目鏡。它是眼透鏡,可行升降調節,具有較長的焦距的一種望遠目鏡。鏡筒較長,其直徑與觀察目鏡相同。它的功用僅作為環狀光闌的環孔(亮環)與相差物鏡相板的共軛面環孔(暗環)的調中合軸與調焦之用。相差顯微鏡使用時,轉盤聚光器的環狀光闌與相差目鏡必須匹配,且環狀光闌的孔環與相差物鏡相板共軛面的環孔在光路中要準確合軸,并完全吻合或重疊。以保證直射光和衍射光各行其路,使成像光線的相位差轉變為可見的振幅差。但是,鏡體的光路中前述兩環的影像較小,一般目鏡難以辨清,不能進行調焦與合軸的操作,非借助合軸調中望遠鏡不可。

(4)綠色濾色鏡(green filter)

     相差物鏡的種類,從色差消除情況來分,多屬消色差物鏡(achromatic objective)或PL物鏡。消色差物鏡的最佳清清晰范圍的光譜區為510~630nm。欲提高相差顯微鏡的性能最好以波長范圍小的單色光照明,即接物鏡最佳清晰范圍的波長的光線進行照明。所以,使用相差物鏡時,在光路上加用透射光線波長為500~600nm左右的綠色濾色鏡,使照明光線中的紅光和藍光被吸收,只透過綠光,可提高物鏡的分辨能力。該濾色鏡兼有吸熱的作用,以利活體觀察。

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